Pendahuluan
Protein adalah makromolekul yang paling berlimpah di dalam sel hidup dan merupakan 50% atau lebih berat kering sel (Lehninger 1982). Protein merupakan molekul penyusun makhluk hidup. Protein dapat ditemukan didalam seluruh bagian sel. Semua protein dibagun dari rangkaian dasar berupa 20 asam amino yang berikatan kovalen dalam urutan yang khas. Seluruh asam amino memiliki peptida. Ciri utama molekul protein yaitu, memiliki berat molekul yang besar; terdiri atas 20 macam asam amino; terdapat ikatan kimia lain yang menyebabkan terbentuknya lengkungan-lengkungan rantai polipeptida menjadi struktur tiga dimensi protein; Strukturnya tidak stabil terhadap beberapa faktor seperti pH, radiasi, temperatur, medium pelarut organik, dan detergen; umumnya reaktif dan sangat spesifik.
Asam amino merupakan bagian struktur protein dan menentukan banyak sifatnya yang penting (Wirahadikusumah 1977). Glisin merupakan asam amino pertama yang diisolasi dari hidroksilat protein. Asam amino dapat dianalisis dengan menggunakan uji Millon, uji Hopkins-Cole, uji xantoproteat, uji belerang dan uji biuret. Tiap-tiap uji akan menghasilkan hasil reaksi yang berbeda terhadap bahan uji. Uji Millon akan menghasilkan warna merah pada uji positifnya, uji xantoproteat akan menunjukkan warna orange pada uji positifnya, uji belerang akan menunjukkan warna hitam pada uji positifnya, uji biuret akan menunjukkan warna biru keunguan pada uji positifnya, sedangkan pada uji Hopkins-Cole akan menunjukkan cincin ungu pada uji positifnya. Namun, uji Hopkins-Cole tidak dilakukan.
Tujuan
Praktikum bertujuan untuk mengetahui kandungan asam amino secara kualitatif yang ada di dalam albumin, gelatin, kasein, pepton dan fenol dengan cara uji Millon, uji ninhidrin, uji belerang, uji xantoproteat, dan uji biuret, serta mengetahui reaksi yang terjadi pada uji tersebut.
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan pada praktikum kali ini ialah pipet mohr 10 ml, pipet tetes, bulp, gelas piala 100 ml dan 250 ml, botol semprot, tabung reaksi, kaki tiga, kasa, pembakar gas, dan gegep kayu.
Bahan-bahan yang digunakan pada praktikum kali ini ialah pereaksi Millon, albumin 2% dan 0.02%, gelatin 2% dan 0.02%, kasein 2% dan 0.02%, pepton 2% dan 0.02%, fenol 2% dan 0.02%, pereaksi Hopkins-Cole, H2SO4 pekat, pereaksi ninhidrin, NaOH 10% dan pekat, Pb-asetat 5%, HNO3 pekat, CuSO4 0.1%, dan akuades.
Prosedur Kerja
UJi Millon. Lima tetes pereaksi Millon ditambahkan ke dalam tabung reaksi berisi 3 ml larutan protein. Campuran lemudian dipanaskan baik-baik. Warna larutan akan hilang pada saat pemanasan jika pereaksi yang digunakan terlalu banyak. Percobaan ini diujikan terhadap larutan albumin, gelatin, kasein, pepton, dan fenol dengan kosentrasi masing-masing larutan sebesar 2%.
Uji Ninhidrin. Larutan ninhidrin 0.1 % sebanyak 0.5 ml ditambahkan ke dalam tabung reaksi berisi 3 ml larutan protein. Campuran tersebut kemudian dipanaskan dalam penangas air mendidih selama 10 menit. Perubahan warna larutan yang terjadi diperhatikan. Uji ini dilakukan terhadap larutan albumin, gelatin, kasein, pepton, dan fenol dengan konsentrasi masing-masing 0.02 %.
Uji belerang. Larutan protein sebanyak 2 ml ditambahkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 5 ml NaOH 10% kemudian dididihkan beberapa menit. Tambahkan 2 tetes larutan Pb-Asetat 5 % dan pemanasan dilanjutkan selama beberapa menit. Perubahan warna larutan diamati. Uji ini dilakukan terhadap larutan albumin 2 %, gelatin, kasein, pepton, dan fenol dengan konsentrasi masing-masing 0.02%.
Uji Xantoproteat. Larutan protein sebanyak 2 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi 1 ml HNO3 pekat kemudian dicampurkan dan dipanaskan dengan hati-hati. Munculnya warna jingga (kuning tua). Campuran kemudian didinginkan lalu ditambahkan pertetes larutan NaOH pekat sampai larutan menjadi basa. Perubahan warna yang terjadi diamati. Uji ini dilakukan terhadap larutan albumin 2%, gelatin 2%, kasein, pepton, dan fenol dengan konsentrasi masing-masing 0.02%.
Uji Biuret. NaOH 10% sebanyak 1 ml ditambahkan ke dalam tabung reaksi berisi 3 ml larutan protein lalu dikocok. Larutan CuSO4 0.1% sebanyak 1 tetes ditambahkan ke dalam campuran. Campuran dikocok dan apabila tidak timbul warna ditambahkan kembali 1 atau 2 tetes CuSO4 0.1%. Uji ini dilakukan terhadap larutan albumin 2%, gelatin, kasein, pepton, dan fenol dengan konsentrasi masing-masing 0.02%.
Data Pengamatan
Tabel 1 Hasil Uji Millon
| Bahan Uji (2%) | Hasil Pengamatan (+/-) | Perubahan Warna Larutan |
| Albumin | ─ | Putih susu → Kuning |
| Gelatin | + | Tidak Berwarna → Merah |
| Kasein | ─ | Tidak Berwarna → Tidak Berwarna |
| Pepton | ─ | Kuning → Kuning Pekat |
| Fenol | + | Tidak Berwarna → Merah |
Keterangan :
(+) = Mengandung Protein
(-) = Tidak Mengandung Protein
Tabel 2 Hasil Uji Ninhidrin
| Bahan Uji (2%) | Hasil Pengamatan (+/-) | Perubahan Warna Larutan |
| Albumin | + | Tidak Berwarna → Biru Ungu |
| Gelatin | ++ | Tidak Berwarna → Biru Ungu |
| Kasein | ─ | Tidak Berwarna → Tidak Berwarna |
| Pepton | +++ | Kuning → Biru Ungu |
| Fenol | ─ | Tidak Berwarna → Tidak Berwarna |
Keterangan :
(+) = Mengandung Protein
(-) = Tidak Mengandung Protein
Tabel 3 Hasil Uji Belerang| Bahan Uji (0.02%) | Hasil Pengamatan (+/-) | Perubahan Warna Larutan |
| Albumin (2%) | + | Tidak Berwarna → Hitam |
| Gelatin | ─ | Tidak Berwarna → Tidak Berwarna |
| Kasein | ─ | Tidak Berwarna → Tidak Berwarna |
| Pepton | ─ | Tidak Berwarna → Tidak Berwarna |
| Fenol | ─ | Tidak Berwarna → Tidak Berwarna |
Keterangan :
(+) = Mengandung Garam PbS
(-) = Tidak Mengandung Garam PbS
Tabel 4 Hasil Uji Xantoproteat
| Bahan Uji (0.02%) | Hasil Pengamatan (+/-) | Perubahan Warna Larutan |
| Albumin (2%) | + | Tidak Berwarna → Ungu |
| Gelatin | + | Tidak Berwarna→Biru SangatTipis |
| Kasein | + | Tidak Berwarna → Biru Tipis |
| Pepton | + | Kuning → Biru Sangat Tipis |
| Fenol | + | Tidak Berwarna → Biru Tipis |
Keterangan :
(+) = Mengandung asam amino berinti benzena
(-) = Tidak Mengandung asam amino berinti benzena
Tabel 5 Hasil Uji Biuret
| Bahan Uji (0.02%) | Hasil Pengamatan (+/-) | Perubahan Warna Larutan |
| Albumin (2%) | + | Tidak Berwarna → Ungu |
| Gelatin | + | Tidak Berwarna→Biru SangatTipis |
| Kasein | + | Tidak Berwarna → Biru Tipis |
| Pepton | + | Kuning → Biru Sangat Tipis |
| Fenol | + | Tidak Berwarna → Biru Tipis |
Keterangan :
(+) = Mengandung asam amino yang memiliki ikatan peptida
(-) = Tidak mengandung asam amino yang memiliki ikatan peptida
Pembahasan
Protein memiliki lima buah ciri utama. Ciri-ciri tersebut yaitu berat molekulnya yang relatif besar sehingga protein tergolong ke dalam suatu makromolekul. Ciri kedua yaitu umumnya hanya terdiri dari 20 macam asam amino dan asam amino tersebut dapat membantuk suatu ikatan peptida secara kovalen. Ikatan peptida ini dihasilkan dari ikatan yang dibentuk oleh beberapa asam amino. Ikatan ini terjadi antara gugus α-karboksil dari satu asam amino dengan gugus α-amino dari asam amino yang lainnya.
 |
| Gambar 1 Ikatan peptida |
Ciri protein yang ketiga yaitu adanya ikatan kimia lain sehingga menyebabkan terbentuknya lengkungan dalam ikatan polipeptida menjadi struktur tiga dimensi. Contohnya seperti ikatan hidrogen, ikatan Van Der Waals, dan ikatan hidrofob (ikatan polar). Ciri yang keempat yaitu struktur dari molekul protein tidak stabil terhadap beberapa faktor seperti pH, radiasi, dan temperatur. pH yang sangat tinggi (asam atau basa), radiasi yang sangat besar, dan suhu yang sangat tinggi dapat merusak struktur dari protein tersebut sehingga menyebabkan protein tersebut tidak bermanfaat lagi. Ciri yang kelima yaitu protein umumnya sangat reaktif dan sangat spesifik. Hal ini disebabkan oleh adanya gugus samping yang sangat reaktif dan memiliki susunan yang khas pada struktur makromolekunya. Gugus samping yang terikat pada protein seperti gugus kation, anion, hidroksil aromatik, amina, amida, tiol, dan gugus heterosiklik. Asam amino dapat diklasifikasikan ke dalam 4 golongan yaitu asam amino tak mengutub (non polar), asam amino mengutub (polar) tak bermuatan, asam amino bermuatan positif, dan asam amino bermuatan negatif. Rumus umum dari asam amino yaitu :
 | ||
| Gambar 2 Rumus umum asam amino |
Pengujian di dalam percobaan yaitu untuk mengidentifikasi adanya kandungan asam amino yang terdapat di dalam sampel larutan protein. Sampel yang diujikan yaitu albumin, gelatin, kasein, pepton, dan fenol dengan konsentrasi dari masing-masing sampel yaitu 2% dan 0.02%. Kelima sampel protein tersebut diuji dengan lima buah uji yaitu uji Millon, uji ninhidrin, uji belerang, uji Xantoproteat, dan uji biuret.
Uji Millon. Reagen Millon terdiri dari merkuri dan ion merkuro dalam asam nitrat dan asam nitrit. Sampel protein yang mengandung asam amino ketika direaksikan dengan reagen Million akan membentuk garam merkuri dari tirosi yang ternitrasi. Garam yang terbentuk ini akan memberikan warna yang spesifik yaitu warna merah. Warna yang terbentuk tersebut mengindikasikan bahwa sampel yang digunakan mengandung asam amino. Pengujian Millon dilakukan dengan cara mencampurkan 5 tetes reagen Millon ke dalam dalam tabung reaksi berisi 3 ml sampel. Campuran yang kemudian dipanaskan bertujuan untuk mempercepat reaksi antara reagen dengan sampel sehingga terbentuknya garam merkuri lebih cepat. Penambahan reagen tidak boleh terlalu banyak karena warna yang terbentuk pada saat pemanasan akan menghilang.
Hasil yang diperoleh dari percobaan menunjukkan bahwa sampel yang mengandung asam amino yaitu pada sampel larutan gelatin dan fenol dengan konsentrasi masing-masing 2%. Sedangkan sampel yang tidak mengandung asam amino yaitu pada larutan albumin, kasein, dan pepton dengan konsentrasi masing-masing 2%. Warna yang terbentuk dari albumin yaitu kuning (awalnya berwarna putih susu), pada kasein tidak terjadi perubahan warna (awalnya tidak berwarna), dan pada sampel pepton terbentuk warna kuning pekat (awalnya berwarna kuning).
Uji Hopkins-Cole. Uji ini tidak dilakukan dalam praktikum. Pereaksi Hopkins-Cole terbuat dari asam oksalat dan serbuk magnesium dalam air. Larutan protein yang mengandung triptofan dapat direaksikan dengan pereaksi Hopkins-Cole yang mengandung asam glioksilat. Triptofan dapat berkondensasi dengan sejumlah aldehida dengan bantuan asam kuat yang akan membentuk senyawa berwarna. Asam kuat akan menyebabkan terbentuknya cincin ungu pada batas di antara kedua larutan.
Uji ninhidrin. Pengujian keberadaan asam amino dalam sampel dilakukan menggunakan larutan ninhidrin yang ditambahkan ke dalam tabung reaksi berisi 3 ml larutan sampel. Pemananasan yang dilakukan pada campuran ini bertujuan agar mempercepat reaksi sehingga warna spesifik dari asam amino yang terkandung dapat teramati. Hasil reaksi positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna biru-ungu yang intensitasnya dapat diketahui dengan menggunakan spektrofotometer. Semua asam amino dan peptida yang mengandung gugus α-amino bebas akan memberikan reaksi positif berwarna biru-ungu kecuali pada prolin dan hidroksiprolin. Gugus amino yang terdapat pada kedua asam amino ini tersubstitusi sehingga akan memberikan hasil reaksi positif dengan terbentuknya warna kuning. Reaksi yang terjadi pada uji ninhidrin yaitu:
 |
| Gambar 3 Reaksi pada uji ninhidrin |
Hasil yang diperoleh dari percobaan menunjukkan bahwa sampel yang mengandung asam amino yaitu pada larutan albumin, gelatin, dan pepton dengan konsentrasi masing-masing yaitu 2%. Sedangkan sampel yang tidak mengandung asam amino yaitu pada kasein 2% dan pepton 2%
Uji belerang. Pengujian belerang dilakukan dengan mencampurkan 2 ml larutan protein ke dalam 5 ml NaOH 10% yang kemudian dipanaskan. Penambahan NaOH bertujuan untuk mendenaturasi protein sehingga ikatan yang menghubungkan atom S dapat terputus oleh Pb-asetat membentuk PbS. Penambahan Pb-asetat bertujuan untuk membentuk garam berwarna hitam. Pemanasan dilakukan untuk mempercepat pembentukan garam tersebut. Garam yang dihasilkan yaitu garam PbS yang berwarna hitam. Garam ini terbentuk dalam suasana basa dan berasal dari sulfur (belerang) pada molekul sistein yang bereaksi dengan Pb-asetat. Reaksinya yaitu :
 |
| Gambar 4 Reaksi pada uji belerang |
Hasil percobaan menunjukkan bahwa pembentukan garam PbS hanya pada sampel albumin 2% yang menunjukkan reaksi positif dengan terbentuknya warna hitam pada saat ditambahkan Pb-asetat dalam keadaan dipanaskan. Sampel yang lainnya tidak membentuk garam PbS meskipun telah ditambahkan Pb-asetat secara berlebih. Hasil uji menunjukkan albumin mengandung sistein ataupun metionin.
Uji Xantoproteat. Uji xantoproteat akan menghasilkan warna orange pada reaksi yang menghasilkan turunan benzena dengan penambahan basa. Uji xantoproteat digunakan untuk asam amino yang mengandung inti benzena (Harper 1980). Reaksi yang digunakan adalah reaksi nitrasi pada inti benzena yang terdapat di protein oleh asam nitrat pekat. Reaksi ini positif untuk triptofan, fenilalanin, dan tirosin. Warna hasil reaksi dengan asam nitrat pekat adalah kuning tua, sedangkan warna orange muncul ketika reaksi ditambahkan dengan NaOH sebagai basa. Hasil percobaan menunjukkan albumin, pepton dan fenol positif memiliki inti benzena sedangkan pada gelatin dan kasein menunjukkan warna kuning setelah penambahan basa. Fenol mengalami perubahan warna dari kuning menjadi orange pekat, sedangkan albumin dan pepton mengalami perubahan warna dari kuning menjadi orange. Orange pekat pada fenol menunjukkan adanya inti benzene pada gugus fenol. Hal itu memang sangatlah tepat karena fenol memang memiliki gugus benzena.
Uji Biuret. Uji biuret menghasilkan warna biru keunguan pada asam amino yang mengandung kompleks Cu2+, NH, dan gugus CO dari rantai peptidanya. Senyawa biuret dihasilkan dari urea yang dipanaskan didalam air panas. Suasana basa akan memberikan warna biru keunguan pada asam amino yang bereaksi dengan CuSO4. Suasana basa dihasilkan dari penambahan NaOH 10% sedangkan penambahan CuSO4 0,1% berfungsi untuk menghasilkan warna biru keunguan pada reaksi yang positif memiliki gugus Cu2+, NH dan gugus CO pada ikatan peptidanya. Albumin memiliki gugus bangun yang kompleks dan mengikat dua atau lebih asam amino esensial, sehingga terbentuk ikatan peptida. Semakin banyak ikatan peptida yang dimiliki warna ungu yang terbentuk akan semakin nyata (Gilvery 1996). Gambaran proses terbentuknya ikatan peptida:
 |
| Gambar 5 Proses terbentuknya ikatan peptida |
Hasil pengamatan menunjukan hasil positif untuk bahan uji albumin 2%, gelatin, kasein, pepton dan fenol. Hanya saja pada albumin dihasilkan warna violet, pada gelatin dihasilkan warna biru sangat tipis, pada kasein dihasilkan warna biru tipis, pada pepton dihasilkan warna biru sangat tipis dan pada fenol dihasilkan biru tipis. Warna yang dihasilkan dari uji biuret menunjukkan ikatan peptida terbanyak ada pada albumin, sedangkan pada bahan uji lain ikatan peptidanya tidak sebanyak albumin karena warna yang dihasilkan adalah biru muda. Jadi, ikatan peptida terbentuk apabila ada dua atau lebih ikatan peptide (Harrow 1954).
Simpulan
Hasil yang diperoleh dari percobaan dengan berbagai uji dan reagen menunjukan bahwa sampel-sampel yang mengandung asam amino yaitu pada sampel gelatin dan fenol (uji Millon), albumin, gelatin, dan pepton (uji ninhidrin), albumin 2% (uji belerang), albumin (2%), pepton, dan fenol (uji xantoproteat), dan pada semua sampel protein (uji biuret).
Daftar pustaka
Gilvery, et al. 1996. Biokimia Suatu Pendekatan Fungsional Edisi 3. Surabaya: Airlangga University Press.
Harper, et al. 1980. Biokimia (Review Of Physilogical Chemistry) Edisi 17. Jakarta: EGC
Harrow. 1954. Textbook Of Biochemistry 6th Edition. U.S.A: Saunders Company.
Lehninger. 1982. Dasar-dasar Biokimia. Penerjemah: Maggy Thenawijaya. Jakarta: Erlangga.
Wirahadikusumah, Muhammad. 1997. Biokimia: protein, enzim, dan asam. Bandung: Penerbit ITB.
By: Deo Singgih Arestu, Dwi Eryono Kasiha dan, Mareti Primadona
0 komentar:
Posting Komentar